용해 완충액
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1. 개요
용해 완충액은 분자, 특히 단백질을 분리하고 안정적인 환경에서 보존하기 위해 사용된다. 완충액 선택은 실험 목적, 단백질의 특성, 세포 환경에 따라 달라지며, pH, 이온 강도, 세제 사용, 단백질 분해 효소 억제제 등의 요소를 고려해야 한다. 일반적인 용해 완충액으로는 NP-40, RIPA, SDS, ACK, GentleLys 등이 있으며, 각 완충액은 특정 목적과 조성으로 사용된다. 세포 용해 과정에서 계면활성제, 염, 효소 등의 첨가제를 사용하여 세포막을 파괴하고 표적 분자를 방출시키며, DNA 및 RNA 연구에도 활용된다.
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| 용해 완충액 | |
|---|---|
| 개요 | |
| 사용 목적 | 세포 용해 및 단백질 추출 |
| 주요 성분 | 완충액, 염, 세제, 단백질 분해 효소 억제제 |
| 작용 원리 | 세포막 파괴 및 세포 내용물 용해 |
| 성분 | |
| 완충액 | pH 유지 |
| 염 | 단백질 안정화 |
| 세제 | 세포막 용해 |
| 단백질 분해 효소 억제제 | 단백질 분해 방지 |
| 고려 사항 | |
| pH | 최적 pH 유지 |
| 온도 | 낮은 온도 유지 (단백질 분해 방지) |
| 세제 종류 | 실험 목적에 맞는 세제 선택 |
| 염 농도 | 단백질 안정성에 영향 |
| 단백질 분해 효소 억제제 종류 | 광범위하거나 특정 효소 억제 |
| 용도 | |
| 단백질 정량 | 세포 내 단백질 농도 측정 |
| 단백질 전기 영동 | 단백질 분리 및 분석 |
| 웨스턴 블로팅 | 특정 단백질 검출 |
| 질량 분석 | 단백질 식별 및 정량 |
| 효소 활성 분석 | 효소 활성 측정 |
2. 완충액 선택
용해 완충액의 주요 목적은 관심 있는 분자를 분리하고 안정적인 환경에 보존하는 것이다. 단백질과 같은 분자를 다룰 때, 일부 실험에서는 목표 분자를 완전히 변성시켜야 할 수도 있고, 다른 실험에서는 목표 분자가 원래의 접힌 구조와 기능을 유지해야 할 수도 있다. 또한, 서로 다른 단백질은 고유한 특성을 가지며 다양한 세포 환경에서 발견된다.
따라서 실험의 목적과 설계에 따라 최적의 완충액을 선택하는 것이 중요하다. 완충액 선택 시 고려해야 할 핵심 요소로는 pH, 이온 강도, 세제의 필요성 및 종류, 그리고 원치 않는 분해를 막기 위한 단백질 분해 효소 억제제나 기타 효소 억제제(예: 인산분해효소 억제제)의 첨가 여부 등이 있다.[2][3] 이러한 요소들은 실험 대상(예: 그람 음성균 또는 그람 양성균)이나 연구 목표(예: 단백질 인산화 연구)에 따라 달라질 수 있다.[2][3]
2. 1. 완충액 (Buffer)
완충액은 단백질이 안정적으로 존재할 수 있는 환경을 만들어 준다. 각 완충액은 작용하는 특정 pH 범위가 정해져 있다. 따라서 실험하려는 단백질이 특정 pH에서 안정적인지를 고려하여 적절한 완충액을 선택해야 한다. 비슷한 pH 범위를 가진 완충액 중에서는 실험 대상 단백질과 잘 맞는지(호환성)도 고려해야 한다.[4]아래 표는 흔히 사용되는 완충액의 종류와 해당 pH 범위를 보여준다.[4]
2. 2. 첨가제 (Additives)
용해 완충액은 단순히 pH를 일정하게 유지하는 것 외에도, 실험 목적에 따라 다양한 첨가제를 포함하여 목표 분자를 효과적으로 분리하고 안정적인 상태로 보존하는 데 중요한 역할을 한다.[2] 예를 들어, 어떤 실험에서는 목표 단백질을 완전히 변성시켜야 할 수도 있고, 다른 실험에서는 단백질이 원래의 접힌 구조와 기능을 유지해야 할 수도 있다. 또한, 단백질마다 고유한 특성이 있고 세포 내 환경도 다르기 때문에, 실험 설계에 맞춰 최적의 첨가제를 선택하는 것이 필수적이다.[2]주요 고려 요소로는 완충액의 pH, 염을 통해 조절되는 이온 강도, 세포막 파괴 및 단백질 용해를 위한 세제 사용 여부, 그리고 원치 않는 단백질 분해를 막기 위한 단백질 분해 효소 억제제 등이 있다.[2] 예를 들어, 세포벽 구조가 다른 그람 음성균을 용해할 때는 세포막 파괴를 돕기 위해 세제를 첨가해야 하지만, 그람 양성균의 경우에는 반드시 필요하지는 않다.[3] 또한, 단백질 인산화와 같이 특정 생화학적 과정을 연구할 때는 단백질 분해 효소 억제제뿐만 아니라 인산분해효소 억제제와 같은 다른 특정 효소 억제제를 함께 첨가하여 목표 분자의 변형 상태를 그대로 유지하기도 한다.[2]
2. 2. 1. 염 (Salts)
용해 완충액은 대개 하나 이상의 염을 포함한다. 용해 완충액에서 염의 기능은 완충액 용액 내에 이온 강도를 확립하는 것이다.[4] 염은 또한 최적의 삼투압 조건을 유지하고 세포 파괴를 촉진하기 위해 이온 강도를 제공하는 데 도움을 준다.가장 일반적으로 사용되는 염으로는 염화 나트륨(NaCl), 염화 칼륨(KCl), 황산 암모늄((NH4)2SO4) 등이 있다. 이들은 보통 50~150 mM 농도로 사용된다.[4]
특히 염화 나트륨(NaCl)은 용해 과정 동안 삼투압 쇼크와 세포 파괴를 방지하기 위해 등장액 조건을 유지하는 데 자주 포함된다. 염화 칼륨(KCl)도 염화 나트륨과 유사하게 이온 강도를 조절하고 세포 용해를 촉진하는 데 사용될 수 있다.
2. 2. 2. 세제 (Detergent)
세제는 유기 양쪽성(계면활성제)으로, 소수성 꼬리와 친수성 머리 부분을 가진다. 세제의 소수성 부분이 생물막을 둘러싸 막 단백질을 막에서 분리하는 역할을 하므로, 막 단백질 분리에 주로 사용된다.[5] 다양한 세제가 사용되지만, 실험 목적에 맞는 물리적, 화학적 특성을 가진 세제를 선택하는 것이 중요하다. 세제는 주어진 용해 완충액의 용해 강도를 결정하는 주요 성분이기도 하다.[6]
세제는 친수성 머리 그룹의 특성에 따라 다음과 같이 분류된다.[5]
- 비이온성 세제: 비변성(단백질 기능을 방해하지 않음).
- 트리톤 X-100: 온화하면서도 효과적으로 막을 파괴하여 지질과 막 단백질을 용해시킨다. 자주 사용되는 세제 중 하나이다.
- 트윈-20: SDS나 트리톤 X-100보다 더 온화하며, 심각한 변성 없이 막 투과성을 돕고 단백질을 용해한다.
- 음이온성 세제: 변성(단백질 기능을 방해함).
- 도데실 황산 나트륨 (SDS): 단백질의 이차 및 삼차 구조를 파괴하여 변성시키며, 세포막 용해 및 단백질 추출에 사용된다.[6]
- 양이온성 세제: 변성.
- 예: 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드.[6]
- 양쪽이온성 세제: 비변성.
- 예: CHAPS (3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트).[6]
2. 2. 3. 기타 첨가제
용해 완충액에는 주요 성분 외에도 실험 목적에 따라 다양한 물질이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 금속 이온, 글루코스와 같은 당류, 글리세롤, 금속 이온의 활동을 억제하는 EDTA와 같은 금속 킬레이터, 그리고 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 환원제 등이 사용될 수 있다.[4] 또한, 단백질의 인산화 과정을 연구하는 경우에는 단백질 분해 효소 억제제와 함께 인산분해효소 억제제를 첨가하기도 한다.[2]2. 2. 4. 무계면활성제 세포 용해 완충액
많은 세포 용해 완충액은 용해 과정 중 단백질 구조를 붕괴시키는 일반적인 문제를 가지고 있는데, 이는 부분적으로 계면활성제의 사용 때문이다. 계면활성제는 종종 적절한 단백질 접힘에 필요한 원래 상태의 복원을 방해한다.[7]오랫동안 계면활성제 기반 세포 용해 후에는 원래 상태를 복원하기 위해 다른 방해 화합물과 함께 계면활성제를 제거하는 완충액 교환 및/또는 투석을 수행해야 했다.[8]
이러한 문제를 극복하기 위해 무계면활성제 세포 용해 완충액 형태의 해결책이 등장했다. GentleLys 완충액은 계면활성제 대신 합성 나노디스크 공중합체를 사용하여 세포막을 부드럽게 파괴한다. 이는 기존의 계면활성제 기반 용해 완충액보다 더 부드러운 대안을 제공하며, 가혹한 화학 물질 없이 단백질과 같은 세포 구성 요소의 올바른 폴딩에 중요한 원래 환경을 유지하면서 효율적인 세포 용해를 가능하게 한다. 결과적으로 단백질은 구조적 완전성과 기능을 유지하며, 이는 계면활성제 기반 완충액의 변성 효과와 현저한 차이를 보인다.
3. 일반적인 용해 완충액
세포나 조직에서 특정 성분을 추출하거나 분석하기 위해 다양한 종류의 용해 완충액(Lysis buffer)이 사용된다. 각 완충액은 포함된 세제의 종류와 농도, 염(salt) 농도, pH 등이 달라 특정 실험 목적에 맞게 선택된다. 일반적으로 사용되는 용해 완충액에는 다음과 같은 종류들이 있다.
- '''NP-40 용해 완충액''': 비이온성 세제인 NP-40 또는 트리톤 X-100을 주로 사용하여 단백질의 구조와 기능 손상을 최소화하면서 세포를 용해할 때 사용된다. 상대적으로 순한 용해 조건이 필요할 때 적합하다.[9]
- '''RIPA(RadioImmunoPrecipitation Assay) 용해 완충액''': 면역침전법이나 세포 및 조직에서 전체 단백질을 추출할 때 널리 사용된다. NP-40 외에 데옥시콜산나트륨이나 SDS와 같은 이온성 세제를 포함하여 용해력이 강하며, 단백질 간의 약한 상호작용을 파괴하는 경향이 있다.[10][9]
- '''SDS(sodium dodecyl sulfate) 용해 완충액''': 강력한 이온성 세제인 SDS를 포함하여 단백질을 완전히 변성시키고 용해시키는 데 사용된다. 특히 겔 전기영동 분석을 위한 시료 준비 등에 활용된다.[10]
- '''ACK(Ammonium-Chloride-Potassium) 용해 완충액''': 주로 혈액 샘플에서 적혈구를 선택적으로 용해시키는 데 사용된다. 삼투압 차이를 이용하여 적혈구를 파괴하며, 백혈구와 같은 다른 세포들은 비교적 온전하게 유지시킨다.[11][12][13]
3. 1. NP-40 용해 완충액
가장 널리 사용되는 용해 완충액 중 하나일 수 있다. 주요 가용화제는 NP-40이며, 필요에 따라 트리톤 X-100과 같은 다른 세제를 사용하거나 농도를 조절할 수 있다. NP-40은 비이온성 세제이기 때문에, 이 완충액은 RIPA 완충액보다 더 순하게 작용한다. 따라서 단백질의 기능을 최대한 보존해야 할 때 유용하게 사용된다.[9]조성[9]
3. 2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) 용해 완충액
RIPA 완충액은 면역침전법 및 세포와 조직에서 단백질을 추출하는 데 일반적으로 사용되는 용해 완충액이다. 바나데이트가 없는 경우, 이 완충액은 4°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있다.[10] RIPA 완충액은 세포에서 단백질을 방출시키는 역할뿐만 아니라, 단백질 간의 약한 상호 작용 대부분을 파괴하는 특징이 있다.[9]RIPA 완충액의 일반적인 조성은 다음과 같다.[10]
| 성분 | 농도 | 비고 |
|---|---|---|
| 노니데트 P-40 (NP-40) | 1% (w/w) | |
| 데옥시콜산나트륨 | 1% (w/v) | |
| SDS | 0.1% (w/v) | |
| NaCl | 0.15 M | |
| 인산나트륨 | 0.01 M | pH 7.2 |
| EDTA | 2 mM | |
| 플루오르화나트륨 (NaF) | 50 mM | |
| 오르토바나듐산나트륨 (Na3VO4·2H2O) | 0.2 mM | 신선하게 사용, 포스파타아제 억제제 |
| 프로테아제 억제제 (예: 아프로티닌) | 100 U/ml |
3. 3. SDS (sodium dodecyl sulfate) 용해 완충액
SDS(sodium dodecyl sulfate)는 이온성 변성 세제이다. 뜨거운 SDS 완충액은 단백질을 완전히 용해하고 변성시켜야 할 때 자주 사용된다.'''조성'''[10]
- 0.5% (w/v) SDS
- 0.05 M 트리스⋅Cl
- pH를 8.0으로 조정
- 신선한 디티오트레이톨 (DTT) 1 mM 첨가
3. 4. ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) 용해 완충액
ACK는 백혈구와 같이 다른 세포에 더 큰 관심이 있는 생물학적 샘플에서 적혈구의 용해에 사용된다.[11]제조법은 다음과 같다:[12][13]
- 150 mM 염화 암모늄
- 10 mM 탄산 수소 칼륨
- 0.1 mM EDTA
- pH를 7.2-7.4로 조절
3. 5. GentleLys (Gentle Lysis)
많은 세포 용해 완충액은 용해 과정 중 단백질 구조가 붕괴되는 문제를 안고 있는데, 이는 부분적으로 계면활성제 사용 때문에 발생한다. 계면활성제는 종종 적절한 단백질 폴딩에 필요한 원래 상태의 복원을 방해한다.[7]오랫동안 계면활성제 기반 세포 용해 후에는 원래 상태를 복원하기 위해 다른 방해 화합물과 함께 계면활성제를 제거하기 위한 완충액 교환 및/또는 투석 과정이 필요했다.[8]
이러한 문제를 극복하기 위해 계면활성제가 없는 세포 용해 완충액 형태의 해결책이 등장했다. 대표적인 예로 [https://cube-biotech.com/products/proteomics/cell-lysis-buffers/gentlelys-native-cell-lysis-buffer/gentlelys-sample GentleLys] 완충액이 있다. 젠틀라이스 완충액은 계면활성제 대신 합성 나노디스크 공중합체를 사용하여 세포막을 부드럽게 파괴하며, 이는 기존의 계면활성제 기반 용해 완충액보다 더 부드러운 대안을 제공한다. 이러한 부드러운 접근 방식은 가혹한 화학 물질의 필요성을 없애 단백질과 같은 세포 구성 요소의 올바른 폴딩에 중요한 원래 환경을 유지하면서 효율적인 세포 용해를 가능하게 한다. 결과적으로 단백질은 구조적 완전성과 기능을 유지하게 되는데, 이는 계면활성제 기반 완충액의 변성 효과와 뚜렷한 차이를 보인다.
4. 세포 용해와 효소 정제
세포 용해는 세균 세포에서 효소를 정제하는 데 중요한 단계이다. 효과적인 세포 파괴와 표적 효소의 방출을 위해 다양한 성분들이 용해 완충액에 포함된다. 용해 완충액의 주요 목적은 관심 있는 분자를 분리하고 안정적인 환경에 보존하는 것이다.[2] 단백질 정제의 경우, 실험 목적에 따라 단백질을 완전히 변성시키거나 원래의 접힌 구조와 기능을 유지해야 할 수 있다. 따라서 실험 목적과 설계에 맞는 최적의 완충액을 선택하는 것이 중요하다. 이때 고려해야 할 주요 요소는 pH, 이온 강도, 세제 사용 여부, 그리고 단백질 분해를 막기 위한 단백질 분해 효소 억제제 등이다.[2] 예를 들어, 그람 음성 세균을 용해할 때는 세제를 첨가해야 하지만, 그람 양성 세균에는 필요하지 않을 수 있다.[3] 또한, 단백질 인산화 연구 시에는 인산가수분해효소 억제제와 같은 다른 효소 억제제와 함께 단백질 분해 효소 억제제를 용해 완충액에 첨가하는 것이 일반적이다.
용해 완충액의 주요 성분으로는 계면활성제, 염, 효소 등이 있으며, 각 성분은 용해 과정에서 특정 역할을 수행한다.
'''계면활성제 (세제)'''
계면활성제, 즉 세제는 유기 양쪽성(소수성 꼬리와 친수성 머리) 분자이다. 세제의 소수성 부분이 생체막을 둘러싸 막 단백질을 분리할 수 있기 때문에, 막 단백질 추출에 주로 사용된다.[5] 세제는 친수성 머리 그룹의 특성에 따라 비이온성, 음이온성, 양이온성, 양쪽이온성으로 분류된다.[5] 트리톤 X-100과 같은 비이온성 세제나 CHAPS 같은 양쪽이온성 세제는 단백질 기능을 방해하지 않는 비변성 세제이다. 반면, 도데실 황산 나트륨 (SDS) 같은 음이온성 세제나 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 같은 양이온성 세제는 단백질 기능을 방해하는 변성 세제이다.[6] 세제는 용해 완충액의 용해 강도를 결정하는 주요 요소이다. 세포 용해 과정에서 세균 세포막의 지질 이중층을 파괴하여 막 투과성을 높이고 세포 내 구성 요소, 특히 표적 효소의 방출을 유도한다.
'''염'''
염은 용해 완충액의 이온 강도를 조절하여 최적의 삼투 조건을 유지하고 세포 파괴를 돕는 역할을 한다.
'''효소'''
특정 효소는 표적 효소 추출을 방해할 수 있는 세포 구성 요소(예: 세포벽, DNA, RNA)를 분해하여 세포 용해 효율을 높인다.
아래 표는 용해 완충액에 일반적으로 사용되는 성분들의 예시와 특징을 보여준다.
| 성분 종류 | 주요 역할 | 예시 | 특징 |
|---|---|---|---|
| 계면활성제 (세제) | 세포막 파괴, 세포 내 구성 요소 방출[5] | 트리톤 X-100 | 비이온성, 온화함, 비변성 |
| 도데실 황산 나트륨 (SDS) | 음이온성, 강력함, 단백질 변성[6] | ||
| 트윈-20 | 비이온성, 매우 온화함, 비변성 | ||
| 염 | 이온 강도 조절, 삼투압 유지, 세포 파괴 보조 | 염화 나트륨 (NaCl) | 등장액 조건 유지, 삼투압 쇼크 방지 |
| 염화 칼륨 (KCl) | 이온 강도 조절, 세포 용해 촉진 | ||
| 효소 | 특정 세포 구성 요소 분해, 추출 보조 | 리소자임 | 세균 세포벽(펩티도글리칸) 분해 (특히 그람 양성 세균에 효과적)[3] |
| DNase (데옥시리보뉴클레아제) | DNA 분해, 용해물 점도 감소 | ||
| RNase (리보뉴클레아제) | RNA 분해, 용해물 점도 감소 |
용해 완충액에 포함되는 계면활성제, 염, 효소의 구체적인 조합과 농도는 표적 효소의 종류, 세포 유형, 실험 요구 사항에 따라 달라질 수 있다. 따라서 원하는 효소의 안정성과 활성을 유지하면서 효율적인 세포 용해를 달성하기 위해 이러한 구성 요소의 최적화가 중요하다.
5. DNA 및 RNA 연구에서의 용해 완충액
DNA 지문 분석과 같은 연구에서 용해 완충액은 DNA 분리에 사용된다. 용해 완충액은 세포막과 핵막을 분해하여 DNA가 방출되도록 돕는다. 급하게 필요할 경우, 식기 세척 비누를 대신 사용할 수도 있다. 이 외에도 퀴아젠(Qiagen)에서 판매하는 버퍼 P2(Buffer P2)와 같은 상용 제품들이 용해 완충액으로 사용된다.
참조
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